Bernardyni zostali sprowadzeni do Wilna przez Kazimierza Jagiellończyka w efekcie pobytu w Krakowie św. Jana Kapistrana, płomiennego kaznodziei, który chciał wysłać swoich współbraci z misjami do Kowna i Wilna. Dla monarchy obecność zakonników w stolicy Wielkiego Księstwa Litewskiego była ważna ze względu na ich efektywność misyjną pośród prawosławnej ludności litewskiej i ruskiej, ale też ze względu na prestiż, jako że ich działalnością interesował się papież obdarzając wieloma przywilejami, podobnymi do tych jakie zakonnicy mieli w Ziemi Świętej. Kazimierz Jagiellończyk przekazał bernardynom teren na obrzeżach miastem (zgodnie z zwyczajem zakonu), obok książęcego młyna, wydając akt fundacyjny 30 IX 1469 r. Lokalizacja ta była nieprzypadkowa, bowiem był to obszar zwany wówczas civitas Ruthenica (miasto ruskie), gdzie stał prawosławny sobór, a także mniejsze cerkwie (drewniane).  

Architektura  

Z pierwszego kościoła bernardynów zachowało się dzisiejsze prezbiterium z trójbocznie zamkniętym chórem, z oknami o pełnych łukach, i zakrystia. Było ono gotowe jeszcze przed 1496 r. Korpus świątyni wznoszony zapewne zbyt pośpiesznie na wilgotnym terenie zaczął pękać i w 1500 r. został rozebrany. Do prac na prośbę Aleksandra Jagiellończyka, który przejął po ojcu opiekę nad bernardynami, a którego wspierali Radziwiłłowie, został zatrudniony gdańszczanin Michał Enkinger. W późniejszym czasie stawiał on inny kościół dla bernardynów – św. Anny w Warszawie.    

Ostatecznie powstała trójnawowa, pięcioprzęsłowa hala o czterech parach ośmiobocznych filarów. Przy prezbiterium o typowym mendykanckim charakterze chóru, znajduje się dwukondygnacyjna zakrystia. Z południowej strony do prezbiterium przylega wieża. Dwie wieżyczki znajdują się również przy fasadzie, w której po obu stronach dużego umieszczonego centralnie okna znajdują się ostrołukowe, zdobione maswerkami płyciny. Pierwotnie szczyt świątyni był schodkowy (zmieniony w latach 20.-30. XVII w.).  

Ceglana dekoracja elewacji, gwiaździste, sieciowe i kryształowe sklepienia we wnętrzu odznaczają się wysokimi walorami artystycznymi. Elementy te, podobnie jak schemat hali, zdradzają północną, gdańską proweniencję. Szczególnie bliskie są rozwiązania z kościoła franciszkanów w Gdańsku (prezbiterium do lat 80. XV w., do 1514 halowy korpus).  

W roku 1560 i 1564 klasztor i kościół nawiedziły pożary. W wyniku tych zdarzeń zawaliła się część sklepień, które odbudowano w 1577 r.  

Gotyckie malowidła 

Niezwykle cennym elementem wystroju kościoła są gotyckie malowidła, które odkryto w latach 70. XX w., a które badacze datują na pierwsze dwudziestolecie XVI w. Niegdyś ozdabiały one całą świątynię. Obecnie najlepiej widoczne są na ścianie północnej kościoła. Nieznani twórcy ukazali na nich sceny z życia św. Franciszka i początków zakonu. Można na nich dostrzec także Mękę Chrystusa i adorację Krzyża Świętego. Wyobrażono także św. Krzysztofa i św. Jerzego - patronów Wilna i Litwy oraz liczne figury symboliczne i motywy związane z legendami franciszkańskimi (m.in. brat Sylwester przeganiający złe duchy z Arezzo, św. Antoni wygłaszający kazanie do ryb).  

Rokokowe wyposażenie 

W latach 1763-1767 bernardyni zamówili do swojej świątyni wyposażenie w niepolichromowanym jesionowym i dębowym drewnie (ołtarze, konfesjonały, ambona, stalle). Choć zostało ono w większości zniszczone po 1945 r., kiedy kościół zamknięto, na podstawie zachowanych fragmentów i fotografii archiwalnych trwają prace nad rekonstrukcją. Realizacje te odznaczały się wysokimi walorami artystycznymi. Ich projekt dał nieznany architekt, a realizacji podjęli się m.in. Daniele Giotto, który wykonał ołtarz główny, snycerz Wilhelm Frezer (prace przy trzech ołtarzach i ambonie), stolarze Wincenty Holtz, Johann Karl, Walter i Jakub. 

W tym samym czasie powstał nowy prospekt organowy, 31 głosowy z dwoma manuałami i pedałem, istniejący w nieco tylko zmienionej formie do dziś. Budowniczym organów był organmistrz Mikołaj Janson, który wykonał instrument za kwotę 9000 zł. Pierwotnie były one umieszczone za ołtarzem głównym w prezbiterium, gdyż na zachodniej ścianie kościoła mieścił się balkon dla bernardynek zarzecznych, które w pobliżu miały swój klasztor (instrument przeniesiony na pocz. XX w.). Organy te są najstarszym pewnym dziełem Mikołaja Jansona, znanego organmistrza być może pochodzenia holenderskiego, a snycerkę wykonał z których twórców czynnych przy ołtarzach. Na terenie Litwy istnieje bliźniaczy prospekt w kościele karmelitów bosych Matki Boskiej Szkaplerznej w Linkowie z 1764 r. 

Wokół świątyni 

Zgodnie z charyzmatem zakonnym bernardyni od początku XVII w. rozwijali nabożeństwo Drogi Krzyżowej. Jej stacje były umieszczone przy dziedzińcu kościoła, wraz z kaplicą Świętych Schodów z 1617 r. nawiązującą do Santa Scala zbudowanych przez Sykstusa V w Rzymie. W późniejszym czasie była ona przebudowywana (1746-1752), z dodaniem w 1872 r. strzelistej, neogotyckiej dzwonnicy (proj. Nikołaj Czagin), której kształt dostosowano do stojącego obok kościoła pw. św. Anny.